tema 3: tecnicas de analizis de DNA

Análisis del ADN(también llamada pruebas de ADN o Huella genética) es una técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de su ADN. Su invención se debe el doctor Alec Jeffreys en la Universidad de Leicester en 1984 y fue utilizada por primera vez en medicina forense para condenar a Colin Pitchfork en los asesinatos de Narborough (UK) en 1983 y 1986.
La técnica se basa en que dos seres humanos tienen una gran parte de su secuencia de ADN en común y para distinguir a dos individuos se puede explotar la repetición de secuencias altamente variables llamada microsatélites. Dos seres humanos no relacionados será poco probable que tengan el mismo número de microsatélites en un determinado locus. En el SSR/STR de perfiles (que es distinto de impronta genética) la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para obtener suficiente ADN para luego detectar el número de repeticiones en varios Loci. Es posible establecer una selección que es muy poco probable que haya surgido por casualidad, salvo en el caso de gemelos idénticos, que tendrán idénticos perfiles genéticos pero no las huellas dactilares.
La huella genética se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras de sangre, cabello, saliva o semen. También ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados. Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos, pruebas de paternidad, la compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el establecimiento del origen o la composición de alimentos. También se ha utilizado para generar hipótesis sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.
Los microsatélites muestran una mayor variación que el resto del genoma ya que en ellos se encuentran unas secuencias en distinta repetición y con diferente grado de recombinación debido a la inestabilidad del locus.
Análisis de RFLP:
El análisis consiste en hacer un Southern Blotting (o "Southern blot" que es un método de biología molecular que sirve para verificar si una determinada secuencia de ADN está o no presente en una muestra de ADN analizada) y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tandem de número variable).
En primer lugar el ADN que se va a analizar se separa de otros materiales. A continuación, debe cortarse en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, que son proteínas que cortan el ADN sin dañar las bases. las piezas son clasificadas por tamaño mediante electroforesis en gel. Las piezas con carga positiva se van a la parte superior. El ADN que tiene una ligera carga negativa natural es atraído hacia el fondo. Las piezas más pequeñas se mueven más rápidamente a través del gel, por lo que será aún más hacia la parte inferior de las piezas grandes. Al separar las piezas por tamaño, los más altos se mantienen arriba y los más pequeños debajo. Luego por calor o solución alcalina, se aplica gel con el fin de desnaturalizar el ADN y se separa en fragmentos individuales. Una vez realizado esto el ADN esta ahora listo para ser analizados utilizando una sonda radiactiva de reacción de hibridación.
Para hacer la sonda radiactiva, se necesita la polimerasa del ADN. El ADN que se va someter a la radiactividad se coloca en un tubo de ensayo. A continuación se agrega la polimerasa en el tubo. Se disuelve y se espera a que comience a funcionar. Como los parches de polimerasa de ADN rompen el ADN, los actuales son sustituidos por los nuevos nucleótidos en el tubo. Cada vez que la muestra tenga una base Guanina, la Citosina será puesta en radiactividad. En la repetición del ADN, la polimerasa también se vuelve radioactiva. Las piezas radioactivas están listas para su utilización. Ahora la sonda radioactiva puede ser usada para crear una reacción de hibridación. La hibridación sucede cuando dos secuencias genéticas se unen a causa del hidrógeno que se encuentra en los pares de las bases. Hay dos de estos entre Adenina o Timina y tres de Citosina o Guanina. Para realizar la hibridación el ADN tiene que estar desnaturalizado.
El ADN desnaturalizado radioactivo y la sonda deber ser puestos en una bolsa de plástico con líquido salino y sellado fuertemente. La sonda se adherirá a la desnaturalización de ADN dondequiera que se encuentre de forma apropiada. La sonda y el ADN no tienen que encajar de forma exacta. Este proceso termina haciendo un patrón de ADN de las huellas digitales. Toda persona tiene un VNTRs que ha heredado de uno de sus padres y los VNTRs son únicos para cada persona.
Análisis por PCR:
La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en 1993 por dicho invento.
Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los primeros y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los primeros unidos inespecíficamente al ADN.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o pasos:

DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primeros y una posterior extensión.
HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la unión de los primeros a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá una unión completa.
EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente d

align="justify">esnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.
AmpFLP:
Se trata de una técnica de amplificación de regiones polimórficas (con muchos polimorfismos), preferiblemente el lócus D1S80. Este análi.sis pueden ser automatizado, y permite la fácil creación de árboles filogenéticos basados en la comparación de las muestras individuales de ADN.
Basado en el número variable de repetición en el tandem (VTNR) para distinguir diversos polimorfismos alelos, que son separados en un gel de poliacrilamida utilizado en una escalera alelica (en oposición a un peso molecular). Bandas podrían ser visualizados por tinción de gel de plata. Un lugar popular para la toma de huellas dactilares es el locus D1S80. Al igual que los métodos basados en PCR, el ADN degradado o en cantidades muy pequeñas de ADN puede causar alélica de abandono.
Análisis STR:
Consiste en la amplificación de secuencias con pequeñas repeticiones en tandem que no se conservan dentro de la especie. Una vez amplificadas se separan los fragmentos para comprobar el número de repeticiones (mediante electroforesis capilar o en gel), de forma que se pueden distinguir patrones de repeticiones que pueden ser comparables y asociables.

Este método usa regiones altamente polimórficas que tienen secuencias cortas repetidas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición y estas regiones de la DNA se puede utilizar para diferenciar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primeros específicos de secuencia y se



amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostrados en cada región son de por sí muy comunes, por lo general, cada polimorfismo es compartida por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, es la única combinación de estos polimorfismos de un individuo que hace que este método de discriminación sea un instrumento de identificación. Las regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.

De un país a otro existen diferentes sistemas STR en el análisis de ADN que están en uso. En América del Norte los sistemas que amplifican el CODIS 13 loci núcleo son casi universal, mientras que en el Reino Unido, el sistema de SGM +, que es compatible con la base de datos nacional de ADN esta en uso. Cualquiera que sea el sistema utilizado, muchas de las regiones STR usadas en la prueba son los mismas. Estos sistemas de análisis de ADN se basan en torno a las reacciones múltiplex, el cual muchas regiones STR será sometido a prueba en el mismo tiempo.

Estructura del ADN.La Electroforesis capilar (movimiento mediante la aplicación de un campo eléctrico), permite la inyección de fragmentos de ADN en un tubo de vidrio delgado (capilar) llena de polímeros. El ADN es extraído a través del tubo por la aplicación de un campo eléctrico, la separación de los fragmentos ocurre de tal manera que los más pequeños fragmentos de viajan más rápido a través de los capilares. Los fragmentos son entonces detectados utilizando colorantes fluorescentes que se adjunta a los primeros utilizados en la PCR. Esto permite que múltiples fragmentos amplificados se ejecuten de manera simultánea, algo conocido como multiplexación. Luego se asignan tallas utilizando el tamaño del ADN como normas de etiquetado que se añaden a cada muestra, y el número de repeticiones se determinan comparando el tamaño de la escalera alélica, que contiene una muestra de todos los tamaños comunes de las posibles repeticiones. Aunque este método es costoso, con mayor capacidad de las máquinas y un mayor rendimiento de las que se están utilizando para reducir el costo/muestra es posible reducir los retrasos que existen en muchas instalaciones de la delincuencia gobierno.

Electroforesis en gel es uno de los actos que es utilizado usando principios similares conocidos como "CE", pero en lugar de utilizar un capilar, el gran gel de poliacrilamida se utiliza para separar los fragmentos de ADN. Un campo eléctrico es aplicado, como en la CE, pero en lugar de correr todas las muestras por un detector, los fragmentos más pequeños se ejecutan cerca de la parte inferior del gel y todo el gel es escaneado y guardado en un ordenador. Esto produce una imagen que muestra todos los de las bandas correspondientes a diferentes tamaños y repite la escalera alélica. Este método no requiere el uso de las normas de tamaño, ya que la escalera alélica se ejecuta junto con las muestras y sirve para este propósito. La visualización puede ser a través de la utilización de marcados tintes fluorescentes primeros en la tinción de plata o por el gel antes de escanear. A pesar de que es rentable y puede ser de bastante alto rendimiento, para aplicar la tinción de plata ITS se suspende. Además, muchos laboratorios están eliminación gradualmente geles a favor de la CE, haciendo el costo de las máquinas se haga más manejable.

El verdadero poder del análisis STR se encuentra en el poder estadístico de la discriminación. En los EE.UU., hay 13 centrales loci (lugares de ADN) que se utilizan actualmente para la discriminación en el CODIS. Debido
a que estos lugares usan una variedad de forma independiente (con un determinado número de repeticiones en un locus no cambia la probabilidad de tener cualquier número de repeticiones en cualquier otro lugar), el producto de la regla de probabilidades se pueden aplicar. Esto significa que si alguien tiene el ADN de tipo ABC, en el que los tres loci son independientes, podemos decir que la probabilidad de que ese tipo de ADN es la probabilidad de tener tipo A veces la probabilidad de tener el tipo B veces es la probabilidad de tener el tipo de C. El método de mayor prevalencia de ADN de las huellas dactilares utilizados en la actualidad está basado en la PCR y utiliza corto repite tándem (STR). Este método usa regiones altamente polimórficas que han repetido secuencias cortas de ADN (el más común es de 4 bases repetidas, pero hay otras longitudes en uso, incluyendo bases 3 y 5). Porque diferentes personas tienen diferentes números de unidades de repetición, estas regiones de la DNA se pueden utilizar para discriminar entre las personas. Estos STR loci (lugares) son atacados con primeros específicos de secuencia y se amplifican mediante PCR. Los fragmentos de ADN que son resultado entonces detectados y separados mediante electroforesis. Existen dos métodos de separación y detección, la electroforesis capilar (CE) y la electroforesis en gel.

Los polimorfismos STR mostradas en cada región son de por sí muy común, por lo general, cada polimorfismo será compartido por alrededor de un 5 - 20% de las personas. Cuando observamos múltiples loci, la única combinación de estos polimorfismos de un individuo hace que este método de la discriminación sea un instrumento de identificación. Las demás regiones STR que se ponen a prueba en una persona se convierten en una discriminación de la prueba.
Debido a su costo relativamente bajo y la facilidad para su puesta en marcha y operación, AmpFLP sigue siendo popular en los países de bajos ingresos.
Análisis del cromosoma Y:
Se han creado cebadores específicos para regiones del cromosoma Y que amplifican secuencias solo heredadas por parte paterna. Por e
llo, este tipo de análisis sólo sirve para comparar familiares por parte del padre y varones.








Análisis mitocondrial:

Se usa en muestras muy degradadas, ya que el DNA mitocondrial posee más copias que el nuclear. Se amplifican las regiones HV1 y HV2 y se comparan siempre con familiares por parte materna ya que las mitocondrias son herencia exclusiva de la madre. Los científicos forenses amplían la región HV1 y HV2 del ADNmt y luego cada región es secuenciada en un único nucleótido y se compara las diferencias con la referencia.

preguntas del profesor:

1. ¿Son las muestras de sangre mejores que las bucales?
No exactamente, depende de lo que se este trabajando y el equipo, por ejemplo si se tiene un equipo de gran tecnologia y se estan realizando trabajos de investigacion forences, en la que se requiere 100% de compatibilidad, son más importantes las pruebas de sangre, ya que siempre que se comete algun delito existe una agresion que causa traumas fisicos en las personas, tanto como en el agresor como en la victima, si se tiene la muestra de sangre ya el resto sera investigacion en un laoratorio.

2.¿Que tan precisos son los resultados en las pruebas de ADN?¿Que quiere decir 100% exclusión de paternidad?
Son muy exactos si se esta comprobando una investigacion forence y se encuentra el criminal, tiene que tener 100% de compatibilidad, si no es asi se descartara la persona. Si se esta buscando una prueba de paternidad y se encuentra que el señor es el padre decierta persona puede llegar a tener 99% de compatibilidad. 100% de exclucion paternal significa que el supuesto padre biologico que se esta buscando no es ese, ya q no tienen nunguna compatibilidad en su ADN.
3.¿Es necesario que la madre también se analice?
Si es para una prueba de paternidad no es necesario, ya que se analiza el 50% de ADN del niño y del padre el 100%. Pero si es en caso de alguna desaparición si seria necesario hacerla.
4.¿Se puede hacer pruebas de paternidad prenatales?
Si se pueden hacer pero resulta muy riesgoso tanto como para el feto como para la made, puede llegar a causar la muerte.
5.¿Se puede hacer una prueba de paternidad sin el consentimiento de la madre? Desde el punto de vista legal habira que revisar la constitución del país, pero desde el punto de vista moral se pueden hace, ya que cada uno tiene derecho de saber si cierto niño es su hijo, pero si son pruebas prenatales no se deben hacer
6.¿Porque algunos resultados de indice combinado de paternidad dan 99.98% y otros 99.9999995% ?, por ejemplo
Por la secuencia de los nucleótidos, en ambos casos si se demuestra que se es padre, por ejemplo si algo fallo en los equipos daría un 99.98% y si no daría 99.9999995%, pero esto no es una diferencia significativa